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    lncRNA测序实验设计和验证方法!
           最近中洪君(ID:boyaun6668)一直跟大家聊lncRNA研究策略,上次我们聊了lncRNA测序这个话题,今天我们来聊聊验证实验设计和验证方法。

           如果做了lncRNA测序,人家高分文章中测序数据通常就占到整篇文章的20-30%,实验设计占到20%,50%-60%都是验证实验,验证实验设计是怎么个逻辑,需要怎么做呢?


           验证实验设计的逻辑是这样的:

           如果是发现新的lncRNA:

           如果是发现样本间lncRNA差异表达: 




           实验选择是这样的:

           1. 验证发现的lncRNA是真实存在的

           · 可以通过提取RNA做sanger测序验证; 

           · 可以通过probe qPCR,不仅可以对序列进行验证还可以同时检测lncRNA的表达水平,一举两得哦!    
           2. 验证lncRNA表达水平存在差异

           与差异表达mRNA的验证方法相同,设计引物做qPCR验证就OK了,或者做个northern-blot既可以验证RNA的表达丰度又可以验证序列信息,这里就不多做介绍了,大家可以根据自己需求选择。


            验证功能

           如果你觉得做完上面的实验就结束了,小编只能遗憾的告诉你,文章也就登个3分左右的期刊。那么多数据想想确实有些浪费,特别是有新发现。再下功夫做点下面的实验,进一步提高您文章的水平。功能验证完全不知道怎么入手肿么办?


           小编为大家总结了lncRNA验证涉及实验概念,赶紧先睹为快!

           1、cDNA末端快速扩增 

           目的:确定lncRNA 5’和3’末端序列,进而获得lncRNA的全长信息。
           原理:在cDNA合成或第二链cDNA合成的过程中末端序列外侧引入接头序列,通过接头引物和基因特异性引物进行PCR扩增,PCR产物经克隆测序获得末端序列信息。


           2、RNA免疫沉淀

           目的:IP是研究RNA蛋白相互作用的重要手段,利用RIP可以研究在体内蛋白是否与lncRNA发生相互作用。
           原理:利用目的蛋白的抗体免疫沉淀蛋白RNA复合物,从沉淀的RNA蛋白复合物中纯化RNA,进行定量PCR分析。


           3、荧光素酶报告基因

           目的:检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用的一种方法。
           原理:荧光素酶可以催化荧光素(luciferin)氧化成oxyluciferin,在luciferin氧化的过程中,会发出生物荧光(bioluminescence)。然后可以通过荧光测定仪测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光,进而检测转录因子与目的基因启动子区DNA是否发生相互作用。

           4、RNA pulldown
      
           目的:RNA pull-down实验主要用来鉴定与目的lncRNA结合的蛋白配体。
           原理:蛋白与生物素标记的RNA孵育结合,富集的蛋白通过SDS-PAGE分离,最后选择特异性蛋白条带进行质谱鉴定。


           5、染色质免疫共沉淀 

           目的:ChIP主要用于研究lncRNA—蛋白质—染色质DNA相互作用,探究 lncRNA对特定染色质修饰蛋白或转录因子的调控作用。
           原理:在活细胞状态下固定蛋白-DNA复合物,超声将DNA随机打断为一定长度范围内的染色质小片段,再通过抗体捕获蛋白-DNA复合物,特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段。



           案例分析

           小编结合两篇系统性研究lncRNA的经典案例,从分子机制研究及肿瘤基础研究两方面,与大家聊聊lncRNA测序及后期验证该怎么做。


           1、分子机制研究
           lncMyoD通过阻碍IMP2介导的mRNA翻译调控骨骼肌分化
           期刊:Developmental Cell
           IF:9.338

           文章简介
           本文应用RNA-seq技术,寻找成肌细胞与早期肌管的差异分子,发现并鉴定出lncMyoD,并从其对邻近靶基因MyoD与下游基因调控方式两方面探讨lncMyoD的调控机制。
           分析思路
           1、发现和鉴定lncMyoD
           A. RNA-seq寻找差异分子;
           B. 根据基因位置关系确定lncMyoD。
           2、lncMyoD序列及表达模式特征
           A. RACE确定lncMyoD序列;
           B. lncMyoD表达的时间、空间及组织特异性分析;
           C. lncRNA被定位于细胞核,在成肌细胞及肌管中特异性表达并具有时间特异性;
           D. lncMyoD编码蛋白能力生物信息学预测及实验验证,无蛋白编码能力。
           3、lncMyoD是MyoD的直接靶标
           A.  沉默lncMyoD不影响MyoD基因表达,而沉默MyoD基因可使lncMyoD表达下调,从而得出结论:MyoD在lncMyoD的上游;
           B.  通过CHIP和荧光素酶报告基因实验,验证MyoD可介导lncMyoD的转录激活,从而上调lncMyoD表达。
           4、筛选lncMyoD下游调控靶基因
           A. 为寻找lncMyoD调控的下游靶基因,通过RNA pulldown检测到IMP2蛋白;
           B.  lncMyoD 表达沉默后IMP2蛋白水平上调。(研究发现IMP2蛋白能直接结合并调控IMP2 mRNA,从而增加其自身mRNA的稳定性或翻译。 lncMyoD表达沉默增加了IMP2蛋白和IMP2 mRNA的结合稳定性,使得IMP2蛋白水平上调。)
           C. lncMyoD负向调控IMP2介导的增殖基因(N-Ras和c-Myc)的翻译。(lncMyoD竞争性的结合IMP2蛋白,使得IMP2介导的增殖基因(N-Ras和c-Myc)的翻译受阻。)

           2、肿瘤基础研究
           Lnc-GCASPC作为MiR-17-3P靶标,负向调控胆囊癌PC蛋白依赖性细胞增殖
           期刊:Cancer research
           IF:8.556

           文章简介:
           本研究表明lncRNA-GCASPC在肿瘤组织中表达量下调,在胆囊癌(GBC)发展中发挥关键作用。lncRNA-GCASPC是miR-17-3P的靶标基因,且能够负向调控丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase,PC)的表达,为揭示胆囊癌中lncRNA调控细胞增殖机制,阐明其致病机制提供新的基础。

           分析思路:
           1、分子筛选及鉴定
           A.  针对5个胆囊癌患者的癌及癌旁组织进行表达谱测序,分析差异表达的lncRNA及mRNA;
           B.  应用qRT-PCR在15对癌及癌旁组织样本中验证,筛选出肿瘤组织中显著下调且保守的lncRNA-GCASPC(以下简称GCASPC)。加大样本量验证,证实GCASPC在131个GBC病人组织样本中显著下调,并与病人预后相关;
           C.  生物信息学预测蛋白编码能力,确定lncRNA-GCASPC无蛋白编码能力;
           D.  鉴定lncRNA表达特异性,定位于细胞质。
           2、细胞及动物实验的功能验证
           A. 细胞实验:过表达GCASPC能够抑制细胞增殖,敲除GCASPC能促进肿瘤生长;
           B. 动物实验:GCASPC表达与肿瘤大小相关,且与肿瘤分期、预后相关。其表达量越高,预后效果越好。
           3、lnc-GCASPC下游靶分子的功能验证
           A. 通过RNA pull-down及质谱检测,发现了下游靶分子-丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase,PC)简称PC蛋白;
           B. 过表达GCASPC,PC蛋白表达活性下降、mRNA水平无变化,表明GCASPC可能是通过翻译或翻译后调控PC蛋白的表达活性。
           4、lnc-GCASPC上游分子miR-17-3p研究
           A. miRDB预测到miR-17-3p可与GCASPC配对,并通过荧光素酶报告基因验证两者具有结合作用;
           B. 干扰/过表达miR-17-3p能影响GCASPC的表达,而干扰/过表达GCASPC不引发miR-17-3p的表达变化,验证GCASPC是miR-17-3p的靶基因;
           C. 验证miR-17-3p的功能,敲除后可抑制细胞增殖。

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