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    PCNA步骤

     一.   服务介绍                           


           增殖细胞核抗原(ProliferatingCellNuclearAntigen简称PCNA)由Miyachi等于1978年在SLE(系统性红斑狼疮)患者的血清中首次发现并命名,因其只存在于正常增殖细胞及肿瘤细胞内而得名,以后的研究发现PCNA与细胞DNA合成关系密切,在细胞增殖的启动上起重要作用,是反映细胞增殖状态的良好指标,因此近年来掀起了对PCNA研究的热潮,尤其在肿瘤方面。


     二.实验方法                            
    PCNA步骤跟一般的免疫组化步骤基本一样
    1、脱蜡、水化


            1)  60 ℃×20 min→Xylene 2 ×10 minutes;


            2)  100% absolute ethanol:2 ×5 minutes;


            3)  95% ethanol 2 minutes;


            4)  80% ethanol 2 minutes;


            5)  70% ethanol 2 minutes;


            6)  PBS洗3次×3 min


            7)封闭内源性过氧化物酶: 3%的过氧化氢,室温封闭10min


            9)  PBS溶液洗3次×3 min。
    3、抗原修复暴露抗原决定族


           10)  切片放入0.01 M柠檬酸钠缓冲溶液(pH6.0)后,在微波炉里高火4 min至沸腾后,再加热约6 min×4次,每次间隔补足液体,防止干片。
    4、封闭非特异性蛋白


            11)  PBS溶液洗3次×3 min;


            12)  将切片取出,周围水分用滤纸吸干,用组化笔在组织周围画上圈,在圆圈内组织滴入5%羊血清(与二抗来源一致)后放入湿盒中,室温30(10~30)min;
     
    5、一抗孵育


            13)  甩去切片上的羊血清,用滤纸擦干组织周围残留血清,直接加入已稀释的一抗后,放入湿盒中室温1小时,然后4度过夜,从冰箱中取出需37 ℃复温45 min。
     6、二抗孵育


           14)  将一抗倒掉并用PBS洗5 min×5次;


           15)  用滤纸将圆圈周围的水吸去,加入已稀释的二抗后放入37 ℃恒温烤箱中30 min(回收)。


           16)  用PBS洗5次×5 min;
    7、SP反应


           17)  加入SP后放入37度烤箱中30 min。


           18)  用PBS洗5次×5 min;
    8、显色


           19)  加入DAB(快速滴入,观察染色情况,倒掉染液),显色时间控制在约5 min(3~10 min),由镜下观察颜色控制时间。
    9、复染、脱水、透明、封


            20)  用PBS 3次×3min后,用双蒸水洗5 min;


            21)  加一大滴苏木素染液,胞核蛋白染几秒,胞浆或胞膜蛋白染20 s后自来水冲洗,双蒸水洗5 min,再用PBS返蓝5 min。


            22)  脱水:


           70% ethanol 1-2 min


           95% ethanol 1-2 min;


           95% ethanol 1-2 min;


           100% absolute ethanol: (1-2) min;


           100% absolute ethanol: (1-2) min。


            23)  透明:Xylene 1×(1-2) min→Xylene 2×(1-2) min


            24)  封片:中性树胶。

          PCNA步骤

           (本文来源丁香园)


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