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        免疫组化双染实验流程

        一.   服务介绍                           



        实验原理:

               

               标记抗体法虽然具有许多优点,但也存在一些难以克服的问题,如标记抗体的分子增大,对细胞膜和组织的穿透力减弱;化学交联反应对抗体和酶的活性有所影响;结合物中未标记的抗体可与抗原竞争结合,影响检测方法的敏感性等。不标记抗体法可以避免上述的不利影响因素,通过一系统的非标记抗体的免疫学反应,对组织中的抗原进行定位检测。不标记抗体法又可分为用标记物显示和不同标记物显示两种方法。


               前者利用基因工程方法制备双特异性抗体的F(ab′)2,一个Fab片段与标本中的抗原结合,一个Fab是抗体蛋白的结合片段。在抗体与标本作用后,再加入铁蛋白与抗体结合,从而显示组织内抗原的所在部位。后者则用磷酸钨负染后,直接电镜观察。


        二.实验试剂以及材料                     


               1.待检病毒材料  如粪便,气管分泌物、脑脊髓液、组织培养液等。


               2.高速离心机


               3.已知抗体


               4.磷钨酸


               5.琼脂糖


               6.其它



        三.实验方法和步骤                       


        1.经典法


               ① 将被检病毒材料0.9ml,加1︰5~1︰10稀释的特异性免疫血清0.1ml充分混合。


               ② 置37℃作用1h或37℃1h后再置4℃过夜。


               ③ 以17 000r/min~23 000r/min离心90min。


               ④ 吸去上清,将离心管口倒置于滤纸上,吸去残留液体。


               ⑤ 沉淀物中加少量H2O混悬,用3%磷钨酸(pH6.0)负染20Sec~30Sec,滴加于400目铜网Fomnvar膜上,用滤纸从铜网边缘轻轻吸去多余的负染液。


               ⑥ 在透射电镜下4×104倍观察。


        2.快速法(琼脂扩散法)


               ① 制备免疫复合物。


               ② 以生理盐水或pH 7.2巴比妥缓冲液制备1%琼脂糖,趁热浇注于洁净的载玻片上,每片3ml,待冷却凝固后,在凝胶面上等距离放置直径4mm玻璃珠数粒,再于凝胶面上浇注1%琼脂糖2ml~3ml,冷却凝固后,取出玻璃珠,使凝胶形成凹孔。


               ③ 将普通滤纸剪成2×3cm大小,3~4层重叠。用小刀将带有凹孔的琼脂糖切成小块,每块带有一个凹孔,平放在滤纸上。


               ④ 在凹孔内,加入制备好的含病毒的免疫复合物悬液。


               ⑤ 将电镜载网的Fomnvar膜面向下倒悬于液滴上。由于琼脂糖的吸水作用,20min~30min后,可将液滴的水分吸干,而浓缩的免疫复合物则粘附在载网膜上。


               ⑥ 在载网膜上滴加3%磷钨酸负染20Sec,过量的负染液用滤纸在载网边缘轻轻吸去。


               ⑦ 于透射电镜4×104倍下观察。


        结果判定:


               直接观察病毒粒子的形态。由于离心浓缩的处理和特异性抗体的加入,大大提高了观察的敏感性

               非标记抗体免疫电镜技术

               (本文来源百度百科)


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