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    铁蛋白免疫电镜技术

     

     一.   服务介绍                          



           免疫铁蛋白技术是以铁蛋白标记抗体,再以铁蛋白抗体与待检抗原作用。通过电镜检查,观察到铁蛋白抗体所在的位置,即抗原所在。


     二.实验使用试剂                        

       


           1.马脾铁蛋白


           2.硫酸铵


           3.硫酸镉


           4.双异氰酸镉二甲苯(Metaxylene dlisocyante  XC)以0.30Mol/L pH 9.5硼酸盐缓冲液将XC配制成1%溶液。注意配制的水及容器必须特别清洁,配制后放置4℃数天,以不出现沉淀为准。如出现沉淀XC的多聚体形成,应重配。


           5.0.30Mol/L pH 9.5硼盐酸缓冲液


           6.0.1Mol/L硫酸铵液


           7.0.05Mol/L pH 7.4 PBS液



     二.实验方法和步骤                      




    1.铁蛋白的提取


           ① 配制2%硫酸铵液,并以1Mol/L的NaOH或HCl调pH值,正好为5.85。取1g铁蛋白溶于100ml的2%硫酸铵液中。


           ② 加入20%硫酸镉,使最终浓度为5%,混匀,4℃过夜。


           ③ 1 500g离心(4℃)2h,去上清。仍加2%硫酸铵至100ml,混匀,离心,去除不纯沉渣。


           ④ 于上清液中重新加入20%硫酸镉,重复步骤⑵,离心,去上清。


           ⑤ 检查沉渣,置显微镜下检查,应具有典型的黄褐色结晶,结晶为六角形,双一四点结构,如结晶不典型,应继续重复以上步骤。


           ⑥ 以少量的蒸馏水溶解,再加50%饱和硫酸铵溶液,使之沉淀,离心,去上清。


           ⑦ 重复步骤⑹一次。


           ⑧ 以少量蒸馏水溶解,常水透析24h后,以0.05Mol/L pH 7.5PBS透析24h。


           ⑨ 100 000r/min离心2h,去除上部无色上清液(约3/4总量),置4℃过夜。


           ⑽ 用微孔滤膜(孔径0.45μ)过滤,使铁蛋白含量为65mg/ml~75mg/ml,分装,4℃保存不要冻干保存,以免铁蛋白结构遭破坏。

    2.铁蛋白-抗体交联法


           ① 以0.3Mol/L pH 9.5硼酸盐缓冲液将铁蛋白稀释成20mg/ml~25mg/ml。


           ② 以1︰1000(W/W)的比例加入XC液室温搅拌45min,离心去沉淀。


           ③ 以0.3Mol/L pH 9.5硼酸盐缓冲液将提纯lgG配成5mg/ml,以1︰4的比例(V/V)加入IgG与铁蛋白-XC液,4℃搅拌48h。


           ④ 以0.1Mol/L碳酸铵溶液透析过夜,以除去多余的异氰酸盐,再以0.05Mol/l pH 7.5 PBS透析,使pH值恢复到生理水平。


           ⑤ 超速离心  以1.00×105g离心5h,去上清,沉淀以0.05Mol/L PBS悬浮,再次离心,以除去未结合的IgG。


          ⑥ 以血清学及免疫学方法测定结合抗体的特异性、免疫活性以及标记效应,如果操作步骤严格,结果是满意的。

    3.铁蛋白-抗体结合物处理标本


          ① 将标本以5%福尔马林pH 7.2(4℃)PBS液固定40min~60min。


          ② 用冷的PBS液洗涤,离心。


          ③ 如是组织块,则在解剖显微镜下切成更小块,放入试管中,加入铁蛋白-抗体结合物置室温20min,不时振荡,


          ④ 以冷PBS液洗涤三次,离心。


          ⑤ 沉淀以2.5%戊二醛固定20min,以PBS洗涤。


          ⑥ 再以锇酸固定,脱水包埋。


    也可以先超薄切片,再进行铁蛋白-抗体结合物染色。操作如下:


          ① 将培养细胞以1%福尔马林PBS液固定(4℃)。


          ② PBS液洗涤离心。


          ③ 以0.5ml,30%牛血清蛋白PBS液悬浮置入胶透析膜袋中,再将袋置于吸水剂粉末上,待牛血清白蛋白成胶状物时,将透析袋移至2%戊二醛PBS液(pH7.5)中固定3h。


          ④ 取出,切成小块,以PBS液洗涤。


          ⑤ 置干燥器中以硅胶干燥。


          ⑥ 包埋、切片、在水上收集切片置于经4%牛血清白蛋白PBS液处理的披有胶膜的载网上(牛血清白蛋白的处理在于减少铁蛋白结合物非特异性吸附于载网上)。


          ⑦ 滴一滴铁蛋白-抗体结合物于载网上。


          ⑧ 5min后,浮网于PBS液面,标本面向下,以除去多余的结合物。


          ⑨凉干后,滴一滴乙酸双氧铀或氢氧化铅以复染。水洗、晾干、电镜观察。

    四、结果判定


            在已知对照样品成立的前提下,凡是出现黑色的铁分子颗粒即表示抗原的存在,判定阳性(+),否则判为阴性(-)

           免疫铁蛋白技术介绍 

           (本文来源丁香通)


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